sterilisasi kontinyu

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Sterilisasi dapat didefinisikan sebagai suatu usaha mengeliminasi semua kehidupan miksoba yang ada pada bahan/produk yang dikehendaki. Proses sterilisasi yang kurang steril hanya akan menghasilkan steril sebagian (partial sterility) yang berarti masih terdapat mikroba yang dapat tumbuh dan berkembang setelah proses sterilisasi dilakukan.

Proses sterilisasi dapat dilakukan dengan menggunakab proses fisik atau dengan menggunakan bahan kimia (Suriawiria, 1986). Bahan kimia yang dapat digunakan untuk mematikan mikroba antara lain larutan NaCL 9%, KNO₃ 10%, HgCl₂ 0,1%, HCl 1,1%.

Proses fisik untuk sterilisasi dilakukan dengan metode pemanasan dan tanpa pemanasan. Metode dengan menggunakan pemanasan meliputi pemanasan kering (dry heat) dan pemanasan basah dengan menggunakan uap air (moist heat). Metode sterilisasi tanpa menggunakan panas meliputi radiasi (UV, X-Ray), Sonicasi, dan Filtrasi.

1.2  Tujuan Percobaan

Setelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan mampu:

a.       Menguasai teknik sterilisasi media dengan menggunakan panas pada proses batch dan continous.

b.      Memahami pengaruh temperature terhadap kematian mikroba.

c.       Menentukan nilai konstanta laju kematian mikroba (Kd), Desimal reduction time atau destruction value (D), dan konstanta Arhenius (Ed) pada proses sterilisasi.

BAB II

LANDASAN TEORI

2.1 Sterilisasi

            Sterilisasi merupakan salah satu faktor utama dalam fermentasi. Kita tentu mengharapkan tidak terjadi kontaminasi di mana mikroorganisme yang tidak diinginkan tumbuh dan mengganggu proses fermentasi. Teknik sterilisasi berbeda-beda tergantung pada jenis material. Bagian pertama akan menjelaskan secara singkat dan sederhana bagaiman sterilisasi cairan dan padatan.

1. Sterilisasi cairan

Cairan yang disterilisasi umumnya adalah media fermentasi yang mengandung gula, garam fosfat, ammonium, trace metals, vitamin, dan lain-lain.  Secara umum ada dua cara sterilisasi cairan yaitu dengan panas dan disaring (filtrasi).  Sterilasi dengan panas dilakukan di dalam autoclave, di mana steam tekanan tinggi diinjeksikan ke dalam chamber untuk mencapai temperatur 121 derajat C dan tekanan tinggi (sekitar 15 psig).Durasinya bervariasi, namun umumnya diinginkan cairan dipertahankan pada 121 derajat C selama minimal 15 menit. Jika termasuk waktu untuk heating dan cooling steps, total waktu berkisar 1-2 jam tergantung volume cairan yang disterilisasi. Terkadang temperatur bisa diset pada 134 derajat C (untuk medis).

Laboratory autoclave

Untuk skala industri, cairan disterilisasi dengan panas menggunakan beberapa pilihan teknik. Gambar di bawah menjelaskan salah satu bagan proses sterilisasi cairan media di industri. Banyak jenis proses baik secara batch atau continuous yang diterapkan di industri, misalnya direct steam, indirect heating, indirect steam, dan lainnya.

Sterilisasi medium di industri bioproses. Sumber: Doran, M.P (1995), Bioprocess Engineering Principles, chapter 13, Academic Press

Cairan dapat disterilisasi juga dengan disaring menggunakan membrane filter berpori 0.22 atau 0.45 micro meter. Metode ini cocok untuk volume cairan yang kecil (1-2 liter) dan bahan kimia yang bisa rusak karena panas misalnya gula dan protein.

2.  Sterilisasi padatan

Padatan yang umum disterilkan adalah glassware, biosafety cabinet, dan beberapa jenis tabung dan kontainer. Pada glassware dan plastik tahan panas umumnya dilakukan dengan autoclave mirip seperti sterilisasi cairan namun ditambah proses pengeringan. Biosafety cabinet disterilkan dengan bantuan radiasi UV dan disemprot ethanol 70 %. Udara dalam cabinet disaring dengan filter (detilnya akan dibahas di  bagian ke-2 tentang sterilisasi gas).

2.1.1 Jenis-Jenis Sterilisasi

Meski saat ini mikroba telah banyak dimanfaatkan untuk memenuhi kebutuhan manusia, namun seringkali keberadaan mikroba masih dianggap mengganggu, terutama mikroba pathogen. Oleh karenanya, diperlukan upaya untuk mengurangi jumlah mikroba hingga menghilangkannya sama sekali. Untuk tujuan tersebut, dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain:

v  Desinfeksi
Desinfeksi merupakan tindakan pengurangan sebagian besar mikroorganisme dari benda mati. Pada proses desinfeksi ini, tidak semua mikroba dapat dihilangkan.

v   Pasteurisasi
Pasteurisasi merupakan upaya untuk menghindari gangguan mikroba tanpa mematikan sporanya. Pasteurisasi dapat dilakukan dengan cara: Pemanasan pada suhu 62^oC selama 30 menit, pemanasan 71–74^oC selama 20 detik, atau pemanasan 85–87^oC selama 5 detik.

v   Sterilisasi
Sterilisasi merupakan upaya untuk meminimalisasi gangguan mikroorganisme dengan cara menghilangkan “seluruhnya” (bakteri, jamur, parasit, virus, termasuk bakteri endospora). Sterilisasi menjadi hal yang sangat penting dalam berbagai proses bioteknologi, salah stunya dalam proses fermentasi. Meskipun proses fermentasi melibatkan mikroorganisme, namun seringkali kehadiran mikroorganisme lain (kontaminan) tetap mengganggu. Hal ini karena:

1. Medium akan menumbuhkan semua mikroba yang ada (mikroba target dan kontaminan) sehingga produk yang dihasilkan menjadi sangat beragam. Tentu saja hal ini sangat merugikan karena selain mengurangi produktivitas juga menyulitkan dalam proses isolasi.

2. Jika proses fermentasi dilanjutkan dalam keadaan banyak kontaminan, maka kemungkinan produk yang dihasilkan oleh kontaminan menjadi lebih dominan dan mendesak produk mikroba target hingga dapat menghilangkannya.

3.  Kontaminasi pada produk akhir dapat menurunkan kualitas produk, bahkan mungkin dapat membahayakan manusia

4.    Kontaminan dapat merusak produk yang diinginkan

5. Kontaminasi dari suatu fermentasi bakteri dengan “phage” dapat me-lisis kultur.

Untuk menghindari hal–hal tersebut di atas, langkah antisipasi yang dapat dilakukan antara lain dengan:

a. Penggunaan inokulum murni dalam fermentasi

b.Sterilisasi medium: merupakan proses yang bertujuan untuk menghilangkan semua jenis makhluq hidup yang ada dalam media, dilakukan sebelum inokulasi kultur.

c. Sterilisasi ruang fermenter: Penghilangan semua bentuk makhluq hidup dari ruang fermentor, termasuk udara secara kontinyu

d.  Sterilisasi semua bahan yang digunakan dalam keseluruhan proses fermentasi

e. Penjagaan kondisi aseptis selama fermentasi

Fermentasi dapat dilakukan baik secara fisika, kimia, maupun radiasi.Sterilisasi secara fisika dapat dilakukan dengan membunuh mikroba atau sekadar mencegah mikroba masuk kesistem kita.Sterilisasi fisik dengan membunuh mikroba dapat dilakukan dengan penggunaan panas, freezing (pembekuan), penggunaan garam berkonsentrasi tinggi, dll.Sementara sterilisasi fisik tanpa membunuh mikroba dapat dilakukan dengan filtrasi. Filtrasi merupakan upaya untuk meminimalisasi kontaminasi mikroorganisme dengan caramenyaring sesuatu dengan filter berukuran tertentu sehingga sebagian mikroba tidak dapat melewatinya. Cara ini tidak membunuh mikroba yang ada, hanya meminimalisasi agar mikroba tidak terbawa.

Namun, dalam proses fermentasi, cara sterilisasi fisik yang paling mungkin dilakukan adalah dengan filtrasi dan penggunaan panas, baik panas basah maupun panas kering. Sterilisasi panas basah seringkali digunakan untuk sterilisasi media dan bahan–bahan lainnya sementara panas kering untuk sterilisasi alat–alat. Faktor–faktor yang mempengaruhi sterilisasi panas antara lain:

·         Jenis dan jumlah kontaminan yang hendak dihilangkan

·         Morfologi mikroorganisme

·         Komposisi media fermentasi

·         pH

·         Ukuran partikel tersuspensi

·         Temperatur yang digunakan

·          Durasi proses sterilisasi

·         Keberadaan air

Sterilisasi panas dapat dilakukan secara batch maupun continue:

1. Sterilisasi Batch

Sterilisasi sistem batch dapat dilakukan dengan cara menginjeksikan uap panas ke dalam mantel fermentor ayau coil yang terdapat pada bagian dalam fermentor. Cara ini disebut metode tidak langsung. Atau dengan cara menghilangkan uap panas langsung ke dalam larutan medium (metode langsung). Metode langsung membutuhkan uap panas murni, yaitu bebas dari bahan kimia tambahan seperti senyawa antikarat yang panyak digunakan dalam proses produksi uap. Di samping itu, metode langsung akan mengakibatkan bertambahnya volume cairan media dalam fermentor karena adanya kondensasi uap yang digunakan.

2. Sterilisasi Continue

Site mini memberikan keuntungan berupa minimalnya kemungkinan kerusakan medium tetapi mengkinsumsi banyak energi.Temperature yang dibutuhkan untuk sterilisasi sistem ini adalah 140^oC dengan waktu hanya 30 hingga 120 detik.Alat yang digunakan dapat berupa Continues plate heat exchange dan Continues injection flash cooler. Kelebihan Continues injection flash cooler antara lain:

·         Dapat digunakan untuk media yang mengandung bahan padat tersuspensi

·         Biaya lebih murah

·         Mudah dibersihkan

·         Pemanasan dan pendinginan lebih cepat

·         Penggunaan uap lebih efisien

Adapun Kekurangannya antara lain:

·         Dapat terbentuk buih saat pemanasan dan pendinginan

·         Adanya kontak langsung antara media dan uap panas yang murni, yaitu bebas dari bahan anti karat.

2.2 Kinetika Kematian Mikroba

Proses panas secara komersial umumnya didesain untuk menginaktifkan mikroorganisme yang ada pada makanan yang dapat mengancam kesehatan manusia dan mengurangi jumlah mikroorganisme pembusuk ke tingkat yang rendah, sehingga peluang terjadinya kebusukan sangat rendah. Dalam desain proses termal, ada dua hal yang harus diketahui, yaitu karakteristirk ketahanan panas mikroba dan profil pindah panas dari medium pemanas ke dalam bahan pada titik terdinginnya. Karakteristik ketahanan panas dinyatakan dengan nilai D dan nilai Z. Untuk mencapai level pengurangan jumlah mikroba yang diinginkan, amaka ditentukan siklus logaritma pengurangan mikroba. Kemudian dihitung nilai sterilitasnya pada suhu tertentu (Fo). Nilai Fo ini ditentukan sebelum proses termal berlangsung. Nilai Fo dapat dihitung pada suhu standar atau pada suhu tertentu, dimana untuk menghitungnya perlu diketahui nilai D dan nilai Z (Kusnandar, 2008).

Nilai D menyatakan ketahahanan panas mikroba atau sensitifitas mikroba oleh suhu pemanasan. Nilai D didefinisikan sebagai waktu dalam menit pada suhu tertentu yang diperlukan untuk menurunkan jumlah spora atau sel vegetatif tertentu sebesar 90% atau satu logaritmik. Setiap mikroba memiliki nilai D pada suhu tertentu. Semakin besar nilai D suatu mikroba pada suatu suhu tertentu, maka semakin tinggi ketahahan panas mikroba tersebut pada suhu yang tertentu. Nilai D umumnya dinyatakan pada suhu standar. Untuk bakteri mesofilik atau termofilik umumnya menggunakan suhu standar 121^oC, sedangkan untuk sel vegetatif, khamir, atau kapang umumnya menggunakan suhu yang lebih rendah (80-100°C). Nilai D pada suhu standar ini sering dituliskan dengan nilai Do (Anonim, 2009).

Faktor-faktor yang mempengaruhi efektifitas proses thermal pencapaian kecukupan proses panas sangat dipengaruhi oleh banyak faktor. Oleh karena itu, faktor-faktor yang mempengaruhi proses termal harus  dikontrol dengan baik dan dikendalikan. Berdasarkan persyaratan pendaftaran ke FDA, terdapat faktor-faktor kritis yang dapat mempengaruhi proses pemanasan dan sterilisasi, yang dapat berbeda antara satu produk dengan produk lainnya. Di antara faktor-faktor kritis yang perlu diidentifikasi pengaruhnya adalah: (a) karakteristik bahan yang dikalengkan (pH keseimbangan, metode pengasaman, konsistensi/viskositas dari bahan, bentu/ukuran bahan, aktivitas air, persen padatan, rasio padatan/ cairan, perubahan formula, ukuran partikel, jenis pengental, jenis pengawet yang ditambahkan, dan sebagainya), kemasan (jenis dan dimensi, metode pengisian bahan ke dalam kemasan), (b) proses dalam retort (jenis retort, jenis media pemanas, posisi wadah dalam retort, tumpukan wadah, pengaturan kaleng, kemungkinan terjadinya nesting (Anonim c, 2008).

Bacillus cereus merupakan bakteri gram-positif, aerobik, batang pembentuk spora, kadang-kadang memperlihatkan reaksi gram-negatif. Bacillus cereus merupakan bakteri fakultatif anaerob dengan ukuran sel-sel vegetatif dalam bentuk rantai. Beberapa galur bersifat psikotropik, dan galur lainnya bersifat mesofilik dan termofilik. Beberapa tidak dapat tumbuh pada makanan dingin yang disimpan panas pada suhu di atas 60ºC (Anonim, 2009).

Escherichia coli atau biasa disingkat E. coli adalah salah satu jenis spesies utama bakterigram negatif.Bakteri ini umumnya hidup pada rentang 20-40°C, optimum pada 37°C. Pada umumnya, bakteri ini hidup pada tinja, dan dapat menyebabkan masalah kesehatan pada manusia, seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika.Biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan.E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya (Anonim, 2009).

Pseudomonas aeruginosa merupakan patogen utama bagi manusia. Bakteri ini terogolong baketri mesofilik. Bakteri ini kadang-kadang mengkoloni pada manusia dan menimbulkan infeksi apabila fungsi pertahanan inang abnormal. Oleh karena itu, Pseudomonas aeruginosa disebut patogen oportunistik, yaitu memanfaatkan kerusakan pada mekanisme pertahanan inang untuk memulai suatu infeksi. Bakteri ini dapat juga tinggal pada manusia yang normal dan berlaku sebagai saprofit pada usus normal dan pada pasien rumah sakit yang menderita kanker, fibrosis kistik dan luka bakar. Bakteri ini adalah jenis bakteri gram negatif aerob obligat, berkapsul, mempunya flagella polar sehingga bakteri ini bersifat motil, berukuran sekitar 0,5-1,0 µm. Bakteri ini tidak menghasilkan spora dan tidak dapat memfermentasikan karbohidrat (Anonim, 2010).

Jenis dan spesies mikroba berpengaruh terhadap perlakuan panas pada proses sterilisasi. Tabel 2.1 menunjukan ketahanan relative beberapa jenis mikroba terhadap panas yang tinggi. Mikroba yang membentuk spora lebih tahan terhadap pemanasan basah yang paling tinggi jika dibandingkan dengan beberapa jenis mikroba yang lain. Siklus sterilisasi dapat  dirancang berdasarkan pemusnahan spora bakteri, sehingga mikroba jenis lain aka mati secar bersamaan. Suhu yang semakin tinggi pada proses sterilisasi maka waktu yang dibutuhkan untuk mematikan spora akan semakin berkurang.

Table 2.1 Ketahanan Relative Berbagai Mikroba Terhadap Panas Batch

Jenis Mikroba	Ketahanan Relatif Terhadap Panas
Bakteri vegetative dan khamir	1
Virus dan bakteriofage	1-5
Spora kapang	2-10
Spora bakteri	3 x 106

Sumber : J.H (ed), 1988, Chemical Engineers’ Hand Book

Table 2.2 Pengaruh Suhu Dan Waktu Sterilisasi Terhadap Kematian Spora

Suhu Sterilisasi (oC)	Waktu yang Diperlukan untuk Mematikan Spora (menit)
116	30
118	18
121	12
125	8
132	2
138	0,8

Sumber : J.H (ed), 1988, Chemical Engineers’ Hand Book

Pengaruh waktu sterilisasi terhadap jumlah spora yang bertahan menunjukan karakteristik yang berbeda-beda. Karakteristik mikroba atau termofilik pada awal proses sterilisasi mengalami peningkatan populasi spora kemudian dengan bertambahnya waktu sterilisasi spora yang hidup semakin berkurang. Panas yang diberikan pada awal proses justru akan meningkatkan populasi mikroba termofil dan setelah temperature pemanasan mencapai temperature yang mengakibbatkan kematian mikroba (lethal temperature), maka secara perlahan jumlah mikroba yang hidup berkurang.

Bailey & Ollis, (1986) menyatakan bahwa kematian jumlah mikroba oleh pemanasan dapat mengikuti persamaan linear orde -1.

Persamaannya :                           …….(2.1)

                        N         = jumlah mikroba

                        T          = waktu pemanasan

                        K_d          = konstanta laju kematian mikroba

Integrasi persamaan 2.1 menjadi :               …….(2.2)

                        N₀        = jumlah mikroba sebelum pemanasan pada t = 0

                        N_t        = jumlah mikroba setelah pemanasan periode t

Logaritma normal persamaan 2.2 memberikan korelasi linear terhadap waktu,

                                                              …….(2.3)

N₀ sering disebut level kontaminasi (jumlah mikroba sebelum pemanasan kontaminasi mikroba sebelum disterilisasi ) dan N_t adalah level sterilisasi.

            Dalam proses sterilisasi dikenal istilah decimal reduction time atau destruction value (D) yang didefinisikan sebagai waktu yang dibutuhkan dalam meit pada suhu tertentu untuk mengurangi jumlah sel vegetative atau spora sehingga mikroba yang bertahan berkurang menjadi 1/10, sehingga persamaan 2.2 dapat dituliskan :

…….(2.4)

…….(2.5)

            Nilai konstanta laju kematian mikroba (k_d) bergantung pada temperatur, mengikuti persamaan Arhenius:

…….(2.6)

…….(2.7)

            Apabila nilai ln kd dialurkan terhadap 1/T maka akan diperoleh sebuah garis lurus gradient – Ed/R.