Spektrofotometri Visible (Spektro Vis)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible).

Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.

Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible.

Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.

Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin.

Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.


2. Spektrofotometri UV (ultraviolet)

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.

Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.

Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.

Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.

Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung dianalisa.

Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample (Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar.

Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.


3. Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.

Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.


4. Spektrofotometri IR (Infra Red)

Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 μm.

Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.

Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva yang diperoleh.

Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat.

Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang di transmisikan atau yang di absorpsi.

Filter Sinar

λ (nm)  <400 400-450 450-500 500-570 570-590 590-620 620-750 >750

warna UV Violet Biru Hijau Kuning Jingga Merah Infra Merah

Penyerapan sinar uv dan sinar tampak o/ molekul, melalui 3 proses yaitu :

1. Penyerapan o/ transisi electron ikatan dan electron anti ikatan.

2. Penyerapan o/ transisi electron d dan f dari molekul kompleks

3. Penyerapan o/ perpindahan muatan.

Interaksi antara energy cahaya dan molekul dapat digambarkan sbb :

E = hv

Dimana , E = energy (joule/second)

h = tetapan plank

v = frekuensi foton

Penyerapan sinar uv-vis dibatasi pd sejumlah gugus fungsional/gugus kromofor (gugus dengan ikatan tidak jenuh) yang mengandung electron valensi dengan tingkat eksitasi yang rendah. Dengan melibatkan 3 jenis electron yaitu : sigma, phi dan non bonding electron. Kromofor-kromofor organic seperti karbonil, alken, azo, nitrat dan karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang gelombang maksimalnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan. Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elekron bebas, seperti hidroksil, metoksi dan amina. Terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar (bathokromik) yang disertai dengan peningkatan intensitas (hyperkromik).

Komponen dari suatu spektrofotometer berkas tunggal :

1. Suatu sumber energy cahaya yang berkesinambungan yang meliputi daerah spectrum dimana instrument itu dirancang untuk beroperasi.

2. Suatu monokromator, yakni suatu piranti untuk mengecilkan pita sempit panjang-panjang gelombang dari spectrum lebar yang dipancarkan oleh sumber cahaya.

3. Suatu wadah sampel (kuvet)

4. Suatu detector, yang berupa transduser yang mengubah energy cahaya menjadi suatu isyarat listrik.

5. Suatu pengganda (amplifier), dan rangkaian yang berkaitan membuat isyarat listrik itu memadai untuk di baca.

6. Suatu system baca (piranti pembaca) yang memperagakan besarnya isyarat listrik, menyatakan dalam bentuk % Transmitan (% T) maupun Adsorbansi (A).

Skema spektrofotometer ;

Sumber Cahaya..Monokromator….Sampel…Detektor….Amplifier..Piranti Pembaca/Penunjuk

Beberapa jenis spektrofotometer :

1. Spektrofotometer UV-Vis

2. Spektrofotometer Infra merah

3. Spektrofotometer Serapan Atom (SSA)

4. Spektrofotometer Resonansi Magnetik (NMR)

5. Spektrofotometer Pendar Molecular (pendar fluor/pendar fosfor)

6. Spektrofotometer dengan metode hamburan cahaya ( nefelometer, turbidimeter dan spektrofotometer Raman)

Hubungan antara warna dengan panjang gelombang sinar tampak.:

Panjang gelombang warna yang diserap warna komplementer

400-435 nm ungu (lembayung) hijau kekuningan

450-480 nm biru kuning

480-490 nm biru kehijauan orange

490-500 nm hijau kebiruan merah

500-560 nm hijau merah anggur

560-580 nm hijau kekuningan ungu (lembayung)

580-595 nm kuning biru

595-610 nm orange biru kekuningan

610-750 nm merah hijau kebiruan

Pergeseran-pergeseran :

1. Bathokromik, pergeseran ke panjang gelombang yang lebih tinggi dengan energy yang lebih rendah.

2. Hypsokromik(pergeseran biru), pergeseran ke panjang gelombang yang lebih pendek.

3. Hyperkromik, peningkatan absoritivitas molar.

4. Hypokromik, reduksi absortivitas molar.

Penerapan spektrofotometrik

Hukum Beer : Absorbans, log (Po/P), radiasi monokromatik berbanding lurus dengan konsentrasi sutu spesies penyerap dalam larutan.

Hukum Bouguer (Lambert) : Bayangkan suatu medium penyerap yang homogen dalam lapisan-lapisan yang sama tebal. Tiap lapisan menyerap radiasi monokromatik yang memasuki lapisan itu dalam fraksi yang sama seperti lapisan-lapisan lain. Dengan semuanya yang lain sama, maka absorbans itu berbanding lurus dengan panjang jalan yang melewati medium.

Gabungan Hukum Bouguer-Beer, sering di tuliskan sebagai A = abc atau A = εbc

Dengan A = absorbans

ε = absorpsivitas molar (jika konsentrasi dalam molar) dengan satuan M^-1cm^-1

a = absorpsivitas (jika konsentrasi dalam %b/v) dituliskan E^1%_1cm

b = panjang jalan/kuvet

c = konsentrasi ( dalam molar atau %b/v)

Spektra absorpsi sering diyatakan dalam %T maupun dalam bentuk A (absorbansi)

Maka, A = – log (%T)

A = log (P_o/P), P_o adalah daya cahaya masuk dan P adalah daya yang diteruskan melewati sampel.

Beberapa Istilah Dalam Spektrofotometri

Absorbans (A) , A = log (P_o/P)

Absorptivitas (a), tetapan dalam Hukum Bouguer-Beer bila konsentrasi dinyatakan dalam %b/v dan tebal kuvet dalam cm. Dengan satuan liter per gram per sentimeter.

Absorptivitas molar (ε), tetapan dalam Hukum Bouguer-Beer bila konsentrasi dinyatakan dalam molar dan tebal kuvet dalam cm. Dengan satuan liter per mol per sentimeter.

Transmitan (T), fraksi dari daya radiasi yang diteruskan oleh suatu sampel T = P/P_o. Sering dinyatakan sebagai suatu persentase : %T = (P/P_o) x 100%.